En même temps, il réorganisa l'Église romaine, défendant les prérogatives du siège de Pierre et de Paul. Il fixa la liturgie, réforma la discipline ecclésiastique, propagea l'ordre bénédictin, envoya des missionnaires en Angleterre.

Devant l'affaiblissement de l'empire d'Orient, il prit en main la défense de l'empire contre les Lombards, puis il décida de faire la paix avec eux, s'attirant l'hostilité de l'empereur. "J'attends plus de la miséricorde de Jésus, de qui vient la justice, que de votre piété." écrivit-il à l'empereur Maurice. Le pape se tourna alors résolument vers les royaumes barbares de l'Occident, rompant le lien entre christianisme et romanité.

Il se consacra simultanément à l'enseignement. On lui doit de nombreuses oeuvres spirituelles dont les "Dialogues", principale source sur la vie de saint Benoît.

Il mena toujours une vie austère. Il finit ses jours dans la souffrance, avec de fréquents accès de mélancolie.

Lors de l'audience du 4 juin 2008, Benoît XVI a repris sa catéchèse sur saint Grégoire le Grand pour évoquer l'oeuvre de ce Docteur de l'Église, qui "ne s'est pas attaché à élaborer sa doctrine mais a suivi l'enseignement traditionnel de l'Église quant au chemin à suivre pour trouver Dieu". Lecteur passionné de la Bible et auteur d'homélies sur l'Évangile, Grégoire estimait que "le chrétien doit tirer de l'Écriture plus une nourriture quotidienne pour son âme que des connaissances théoriques... Il insistait sur cette fonction de la Bible car ne s'y intéresser que pour un personnel désir de connaissance veut dire céder à la tentation de l'orgueil".

"L'humilité intellectuelle est la règle première pour qui tente de pénétrer le surnaturel à partir de l'Écriture. Ceci, qui n'exclut toutefois pas d'étudier sérieusement, permet d'atteindre des résultats spirituels utiles... Et puis, lorsqu'il s'agit de la Parole de Dieu, comprendre est inutile si cette compréhension ne porte pas à agir". Dans son commentaire de Job, où il suit la tradition patristique, Grégoire "examine le texte à la lumière de son triple sens, littéraire, allégorique et moral... L'idéal moral qu'il commente consiste toujours dans la réalisation d'une intégration harmonieuse entre parole et action, pensée et engagement, prière et service de son état... Ce grand Pape -a ajouté Benoît XVI- trace également pour le vrai croyant un complet projet de vie, qui fut durant le Moyen-âge une sorte de somme de la morale chrétienne".

Son écrit le plus célèbre, la Règle pastorale, propose "un portrait de l'évêque idéal, maître et guide de son troupeau... Le pasteur est avant tout le prédicateur par excellence. C'est pourquoi il doit être avant tout un exemple". Puis le Saint-Père a souligné combien toute "action pastorale efficace doit bénéficier de la connaissance des destinataires et s'adapter à leur situation". Grégoire insistait aussi "sur le devoir qu'a l'évêque de reconnaître chaque jour sa misère afin que l'orgueil ne rende pas vaine l'oeuvre accomplie aux yeux du grand Juge... Tous ces précieux conseils -a-t-il ajouté- montrent la haute conception qu'avait ce Pape du soin des âmes dans ce qu'il nommait l'Ars Artium, l'art des arts... Le dessein théologique qu'il développa dans son oeuvre, le passé, le présent et l'avenir sont relativisés. Pour lui, ce qui compte avant tout est la séquence de l'histoire du salut qui se manifeste quels que soient les méandres du temps... Pour lui, les guides des communautés chrétiennes se doivent de lire les évènements à la lumière de la Parole".

Enfin Benoît XVI a rappelé que parmi ses relations, Grégoire I avait favorisé celles avec les Patriarches d'Antioche et de Constantinople, "se préoccupant sans cesse d'en respecter les droits et évitant toute interférence risquant d'en limiter la légitime autonomie... Si pour des raisons politiques il s'opposa au titre oecuménique du Patriarche de Constantinople...il fut surtout préoccupé...pour l'unité fraternelle de l'Église universelle. Il était surtout profondément convaincu que l'humilité devait être la vertu première de tout évêque mais aussi des patriarches".